发布时间：2025/4/10   浏览次数：101

核心能力十二 能正确完成中药制剂微生物检查

一 、核心概念

1.微生物计数法 用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。

2.非无菌产品微生物限度检查 用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准的方法，除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。

二 、学习目标

能熟练进行中药制剂微生物的检查。

三 、基本知识

药品作为一种防病、治病的特殊商品，除了在理化方面需要有效地控制其质量以外，其微生物检查也尤为重要。药品微生物检查法包含无菌检查法(通则1101)、非无菌产品微生物限度检查法(通则1105、1106、1107)、抑菌效力检查法(通则1121)、异常毒性检查法(通则1141)、热原检查法(通则1142)、细菌内毒素检查法(通则1143)、升压物质检查法(通则1144)、降压物质检查法(通则1145)等。《中国药典》规定，无菌的药品、生物制品、医疗器具、原辅料、原料、辅料及其他品种均应进行无菌检查，非无菌制剂及其原、辅料进行非无菌产品微生物限度检查并应符合标准规定。

四 、能力训练

(一)操作用物

培养皿、无菌室等。

(二)操作内容

1.非无菌产品微生物限量检查：微生物计数法 微生物计数法是用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。

1)简述 非无菌产品微生物限度检查是用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准的方法，除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。非无菌产品微生物限度检查通过检测药品在单位质量(g)或体积(ml)内所含有菌落数，判断药品被污染的程度和安全性，微生物限度的测定结果是对药物生产中原料、工具设备、操作人员及工艺流程等各个环节的卫生状况的整体评价，它是从卫生学角度评价药品受污染程度的一个综合依据。非无菌产品微生物限度检查适用于药品生产、贮存、销售过程中的检验，药用原料、辅料及中药提取物的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，药品质量评估及仲裁等。其标准是基于药品的给药途径、对患者健康潜在的危害以及药品的特殊性而制订的。除另有规定外，其微生物限度应符合以下标准。

(1)制剂通则、品种项下要求无菌的及标示无菌的制剂和原辅料：应符合无菌检查法规定。

(2)用于手术、严重烧伤、严重创伤的局部给药制剂：应符合无菌检查法规定。

(3)非无菌化学药品制剂、生物制品制剂、不含药材原粉的中药制剂的微生物限度标准见表6-7。

表6-7 非无菌化学药品制剂、生物制品制剂、不含药材原粉的中药制剂的微生物限度标准

给 药 途 径	需氧菌总数 /(cfu/g、cfu/ml或cfu/10cm²)	霉菌和酵母菌总数/(cfu/g、cfu/ml或cfu/10cm²)	控 制 菌
口服给药① 固体制剂 液体制剂	10³ 10²	10² 10¹	不得检出大肠埃希菌(1g或 1ml);含脏器提取物的制剂还不得检出沙门菌(10g或10ml)
口腔黏膜给药制剂	10²	10¹	不得检出大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌(lg、1ml或10cm²)
耳用制剂 皮肤给药制剂	10²	10¹	不得检出金黄色葡萄球菌、铜 绿假单胞菌(1g、1ml或10cm²)
呼吸道吸入给药制剂	10²	10'	不得检出大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、耐胆盐革兰阴性菌(1g或1ml)
阴道、尿道给药制剂	10²	10¹	不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌(1g、1ml或10cm²);中药制剂还不得检出梭菌(1g、1ml或10cm²)
直肠给药 固体制剂 液体制剂	10³ 102	10² 10²	不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌(1g或Iml)
其他局部给药制剂	10²	10²	不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌(1g、1ml或10cm²)

注：①化学药品制剂和生物制品制剂若含有未经提取的动植物来源的成分及矿物质，还不得检出沙门菌(10g 或10ml)。

(4)非无菌含药材原粉的中药制剂的微生物限度标准见表6-8。

表6-8 非无菌含药材原粉的中药制剂的微生物限度标准

给 药 途 径	需氧菌总数 /(cfu/g、cfu/ml或cfu/10cm²)	霉菌和酵母菌总数/(cfu/g、cfu/ml或cfu/10cm²)	控 制 菌
固体口服给药 不含豆豉、神曲等发酵 原粉 含豆豉、神曲等发酵原 粉	10⁴(丸剂3×10⁴) 10⁵	10² 5×10²	不得检出大肠埃希菌(1 g);不得检出沙门菌(10g);耐胆盐革兰阴性菌应小于10²cfu(1g)
液体口服给药 不含豆豉、神曲等发酵 原粉 含豆豉、神曲等发酵原 粉	5×10² 10³	10² 10²	不得检出大肠埃希菌(1 ml);不得检出沙门菌(10 ml);耐胆盐革兰阴性菌应小于10'cfu(1ml)
固体局部给药制剂 用于表皮或黏膜不完 整 用于表皮或黏膜完整	10³ 10⁴	10² 10²	不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌(1g或10cm²);阴道、尿道给药制剂还不得检出白色念珠菌、梭菌(1g或10cm²)
液体局部给药制剂 用于表皮或黏膜不完整 用于表皮或黏膜完整	10² 10²	10² 10²	不得检出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌(1ml);阴道、尿道给药制剂还不得检出白色念珠菌、梭菌(1ml)

(5)非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准见表6-9。

表6-9 非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准

检 查 物	需氧菌总数 (cfu/g或cfu/ml)	霉菌和酵母菌总数/(cfu/g或cfu/ml)	控制菌
药用原料及辅料	10³	10²	未做统一规定

(6)中药提取物及中药饮片的微生物限度标准见表6-10。

表6-10 中药提取物及中药饮片的微生物限度标准

检 查 物	需氧菌总数 /(cfu/g或cfu/ml)	霉菌和酵母菌总数/(cfu/g或cfu/ml)	控 制 菌
中药提取物质	10³	10²	未做统一规定
研粉口服用贵细饮片、直接口服及泡服饮片	未做统一规定	未做统一规定	不得检出沙门菌(10 g);耐胆盐革兰阴性菌小于10⁴cfu(1g)

(7)有兼用途径的制剂：应符合各给药途径的标准。

非无菌产品微生物限度检查的项目包括需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数，照“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法(通则1105)"检查；非无菌产品的控制菌照“非无菌产品微生物限

度检查：控制菌检查法(通则1106)"检查。

2)实验准备

(1)环境要求：《中国药典》规定非无菌产品微生物限度检查应符合微生物限度检查的要求。应在不低于D级背景下的B级单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。

(2)供试品的检验量：检验量即一次实验所用的供试品量(g、ml或cm²)。

由于药品受微生物污染的不均匀性和多变性，因此抽样方法、抽样数量和次数直接影响非无菌产品微生物限度检查的结果。非无菌产品微生物限度检查的供试品一般采用随机抽样法，一般应随机抽取不少于2个最小包装的供试品，混合，取规定量供试品进行检验。

除另有规定外， 一般供试品的检验量为10g或10ml;膜剂为100cm²;贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸不得少于4丸，膜剂不得少于4片。

(3)供试液的预处理：根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加热，应均匀加热，且温度不超过45℃,供试液从制备到加入检验用培养基，不得超过1小时。按方法适用性试验确认的方法制备供试液。

3)微生物计数法 供试品检查时，应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数法，检测的供试品量应能保证所获得的实验结果能够判断供试品是否符合规定。供试品的微生物计数法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果，计数法应重新进行适用性试验。计数法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法(简称MPN法)。

4)非无菌产品微生物限度检查按“非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法(通则1105)”检查，按计数法适用性试验确认的计数法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。

非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法包括平皿法、薄膜过滤法及PMN法。

(1)平皿法：包括倾注法和涂布法。

①培养基：胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数。

②供试液检测：将供试品按方法适用性试验确认的方法稀释成不同级别的稀释液(1:100、1:1000、1:10000等)。

a.倾注法：取不同稀释级别供试液1ml,置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超45℃溶化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。

b.涂布法：取15～25ml温度不超过45℃溶化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基注入直径90mm的无菌平皿，凝固，制成平板，采用适宜的方法使培养基表面干燥。每一平板表面接种上不少于0.1ml各稀释级别的供试液，每稀释级每种培养基至少制备2个平板。

③阴性对照组：取制备供试液用的稀释液1ml或不少于0.1ml代替供试液，按上述倾注法，每种计数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。

④培养和计数：除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30～35℃培养3~5天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20～25℃培养5~7天，观察菌落生长情况，点计平板上生长的所有菌落数，计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级2个平板的菌落平均数不小于15,则2个平板的菌落数不能相差1倍或以上。

⑤菌数报告规则：需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级作为菌数报告的依据，霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级作为菌数报告的依据。取最高的平均菌落数，计算1g、1ml或10cm²供试品中所含的微生物数，取两位有效数字报告。如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以小于1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。

(2)薄膜过滤法：所采用的滤膜孔径应不大于0.45 μm, 直径一般为50 mm, 若采用其他直 径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。选择滤膜材质时应保证供试品及其溶剂不影响滤膜材质对微生物的截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为保证滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量不超过100ml,总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤。

① 供试液检测：除另有规定外，按计数法适用性试验确认的方法进行供试液制备。取相当 于 1g 、1 ml或10 cm² 供试品的供试液，若供试品所含的菌数较多，可取适宜稀释级的供试液，照方法适用性试验确认的方法加至适量稀释液中，立即过滤，冲洗，冲洗后取出滤膜，菌面朝上，贴于胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。

②阴性对照组：取与供试液相同体积的稀释液，照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。

③培养和计数：培养条件和计数法同平皿法。

④菌数报告规则：以相当于1g、1 ml或 1 0cm² 供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以小于1报告菌数(每张滤膜过滤1g、1ml或10cm² 供试品),或小于1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。

(3)最可能数法(简称 MPN法):MPN 法的精密度和准确度不及薄膜过滤法和平皿法，仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数法的情况下使用，本法不适用于霉菌计数。

①供试液检测：取供试液至少3个连续稀释级，每一稀释级取3份1ml 分别接种至3管装有9~10ml胰酪大豆胨液体培养基中，同法测定菌液对照组菌数。必要时可在培养基中加入 表面活性剂、中和剂或灭活剂。

② 培养和计数：所有实验管在30～35℃下培养3天，逐天观察各管微生物生长情况。记录每一稀释级微生物生长的管数，查表可知每1g或1ml供试品中需氧菌总数的最可能数。

(4)结果判断：需氧菌总数指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数(包括真菌菌落数), 霉菌和酵母菌总数指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数(包括细菌菌落数)。若采用MPN法，测定结果为需氧菌总数。各品种项下规定的微生物限度标准解释如下。

①10¹cfu: 可接受的最大菌数为20。

②10²cfu: 可接受的最大菌数为200。

③10³cfu: 可接受的最大菌数为2000,依此类推。

若供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检查结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。

5)控制菌检查法 用于在规定的实验条件下，检查供试品中是否存在特定的微生物。本法是非无菌产品微生物限度检查中包含的一种方法，因此供试液制备及实验环境要求同“非无菌 产品微生物限度检查：微生物计数法(通则1105)”。用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准。

供试品控制菌检查中所使用的培养基应进行适用性试验。对于供试品的控制菌检查方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的控制菌检查。若检验程序或产品 发生变化，可能影响检验结果时，对于控制菌检查方法应重新进行适用性试验。

药品控制菌检查项目包括耐胆盐革兰阴性菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、白色念珠菌、生孢梭菌。《中国药典》规定供试品中不得检出控制菌。

控制菌的检查：根据药品的来源、剂型、用途、对患者健康潜在的危害而选择相应的控制菌 进行检查。控制菌的检查方法：根据各控制菌的特性分别进行定性或定量检测，当结果呈阳性 时，应进一步进行适宜的鉴定试验，确证是否为待检控制菌。2.无菌检查法

1)简述  凡进入人体血液循环系统、肌肉、皮下组织或接触创伤、溃疡、烧伤等部位而发生 作用的制品或要求无菌的材料、灭菌器具等应用于临床时，一旦染有活菌且进入患者体内，往往 会引起剧烈的反应，引起并发症，加重病情，甚至威胁生命。因此，对规定灭菌或无菌制剂进行无菌检查，在保证人民用药安全方面有着十分重要的意义。

无菌检查法是用于检查药典要求的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

无菌检查法需用最严格的无菌操作法将被检查的药品或材料的样本分别接种于适合各种 微生物生长的不同培养基中，置于不同的适宜温度下培养一段时间，逐天观察微生物的生长情况，并结合阳性和阴性对照试验的结果，判断供试品是否污染了微生物，从而判断供试品是否合格。

2)实验准备

(1)对环境和操作人员的要求。

①无菌室：必须达到无菌检查的要求，无菌检查应在B级背景下的A 级单向流洁净区域或隔离系统中进行。检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。对于单向流空气区、工作台面及环境，应定期按医药工业洁净室 (区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。对于隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验时还需对实验环境进行监控。

②人员：从事药品微生物实验工作的人员应具备微生物学或相近专业知识的教育背景。实验人员应依据所在岗位和职责接受相应的培训，经考核合格后方可上岗。

③供试品检验数量：一次实验所用供试品最小包装容器的数量，成品每亚批均应进行无菌检查(表6-11至表6-13)。

表6-11 批出厂产品及生物制品的原液和半成品最少检验数量

供 试 品	每批产品N/个	接种每种培养基的最少检验数量
注射剂	≤100 100 >500	10%或4个(取较多者) 10个 2%或20个(取较少者)
大体积注射液(>100 ml)		20个(生物制品) 2%或10个(取较少者) 20个(生物制品)
冻干血液制品 >5ml ≤5ml	每柜冻干≤200 每柜冻干>200 ≤100 100 >500	5个 10个 5个 10个 20个
眼用及其他非注射产品	≤200 >200	5%或2个(取较多者) 10个
桶装无菌固体原料 抗生素固体原料药(≥5g)	≤4 4 >50	每个容器 20%或4个容器(取较多者) 2%或10个容器(取较多者)6个容器
生物制品原液或半成品		每个容器(每个容器制品的取样量为总量的0.1%或不少于10ml,每开瓶一次，应如上法抽验)
体外用诊断制品半成品		每批(抽验量应不少于3ml)
医疗器具	≤100 100 >500	10%或4件(取较多者) 10件 2%或20件(取较少者)

注：若供试品每个容器内的装量不够接种2种培养基，那么表中的最少检验数量应增加相应倍数

④检验量：供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量(g或 ml)。除另有规定外，供试品检验量按表6-12规定。若每支(瓶)供试品的装量按规定足够接种两种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基。采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。

表6-12 上市抽验样品的最少检验量

供 试 品	供试品最少检验数量/(瓶或支)
液体制剂	10
固体制剂	10
V<50 ml 血液制品 V≥50 ml	6 2
医疗器械	10

注：①若供试品每个容器内的装量不够接种2种培养基，那么表中的最少检验数量应增加相应倍数

②抗生素粉针剂(≥5g)及抗生素固体原料药(≥5g)的最少检验数量为6瓶(或支)。桶装无菌固体原料的最少检验数量为4个包装。

表6-13供试品的最少检验量

 

供  试  品	供试品装量	每支供试品接入每种培养基的最少量
液体制剂	V<1 ml 1 ml≤V≤40ml 40 ml<V≤100ml V>100 ml	全量 半量，但不得少于1 ml 20 ml 10%但不少于20 ml
固体制剂	M<50 mg 50 mg≤M<300 mg 300 mg≤M≤5g M>5g	全量 半量，但不得少于50mg 150mg 500mg 半量(生物制品)
生物制品的原液及半成品		半量
医疗器具	外科用敷料棉花及纱布 缝合线、一次性医用材料 带导管的一次性医疗器具(如输液袋) 其他医疗器具	取100 mg或1 cm×3cm 整个材料① 二分之一内表面积 整个器具(切碎或拆散开)

注：①如果医用器械体积过大，培养基用量可在2000ml以上，将其完全浸没。

(2)阳性对照：阳性对照应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及以抗革兰阳性菌 为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；以抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对 照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。阳 性对照试验的菌液制备同方法适用性试验，加菌量小于100 cfu, 供试品用量同供试品无菌检查 时每份培养基接种的供试品量。阳性对照管培养72小时应生长良好。

(3)阴性对照：阴性对照供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为 阴性对照。阴性对照不得有菌生长。

无菌试验过程中，若需使用表面活性剂、灭活剂、中和剂等试剂，应证明其有效性，且对微生物无毒性。

3)操作方法  无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性状允许，应采用薄 膜过滤法。供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与验证的方法相同。

(1)薄膜过滤法： 一般应采用封闭式薄膜过滤器。无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45μm,直径约为50mm。根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。水溶性供试液过滤前应先用少量 的冲洗液过滤，以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。为保证滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100 ml,且总冲洗量不得超过1000ml,以避免滤膜上的微生物受损伤。

(2)直接接种法：适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品，即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中。除生物制品外，一般供试品无菌检查时两种培养基接种的瓶数或支数相等；生物制品无菌检查时硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基接种的瓶数或支数为2:1。除另有规定外，每个容器中接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%,同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml,胰酪大豆胨液体培养基每管装量不少于10ml。供试品检查时，培养基的用量和高度同方法适用性试验。

(3)培养及观察：将上述接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的温度培养14天。上述含培养基的容器按规定的温度培养14天。培养期间应逐天观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，培养3天，观察接种的同种新鲜培 养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。

4)结果判定

(1)阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，实验无效。

(2)若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无细菌生长，判定供试品符合规定；若供试品 管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判定供试品不符合规定，除非能充分证明实验结果无效， 即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少1个条件时方可判定实验结果无效。

①无菌检查所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。

②回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。

③供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和(或)无菌操作技术不当引起的。

实验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判定供试品不符合规定。

5)注意事项

(1)操作前要严格按照消毒程序进行手消毒，戴无菌手套，进入超净台后手要用消毒液擦拭消毒。试剂等的瓶口也要进行擦拭。

(2)点燃酒精灯，操作在火焰附近进行。耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不宜太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成炭膜。

(3)操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。

(4)不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。

(5)吸溶液的吸管等不能混用。

3. 其他微生物检查法 《中国药典》收录的微生物检查法除了无菌检查法和非无菌产品微生物限度检查法外，还包含抑菌效力检查法、异常毒性检查法、热原检查法、细菌内毒素检查法、升压物质检查法、降压物质检查法等。