序号

仪器组成

简   介

1

光源

仪器的光源应能在工作的光谱区域内发射连续的电磁辐射，有足够的辐射强度 和良好的稳定性(辐射能量随波长的变换而波动小)。紫外-可见分光光度计中常用的光源有热辐射光源和气体放电光源两类。热辐射光源用于可见光区，如钨灯、卤钨灯等；气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯等。

(1)可见光区：常用的是钨灯和卤钨灯，它们可发射波长为325～2500 nm的连 续电磁辐射，可用稳定光源的波长为400～780 nm。这类光源的辐射能量与外加 电压有关，必要时可通过配备稳压装置，增强光源的稳定性。

(2)紫外光区：常用氢、氘等放电光源。氢灯和氘灯可使用的电磁辐射的波长范围为160～375 nm,氘灯的灯管内充有氢的同位素氘，其强度比同功率的氢灯大3~5倍，是紫外光区最常用的光源

2

单色器

单色器是能将复合光分散成单色光的光学装置。一般由入射狭缝、准光器、色散原件、聚焦元件和出射狭缝等部分组成。其主要作用是产生纯度高并在紫外-可见光区域内任意可调的单色光。单色器的色散率影响单色光的纯度，进而也影 响测定方法的选择性、灵敏度，还会影响浓度与吸收度曲线之间的线性关系等。

(1)棱镜单色器：色散原理是依据光的折射率不同，将其分成不同波长的单色光，常见的有玻璃棱镜和石英棱镜两种。玻璃棱镜可色散波长范围为350～3200nm的光，可色散可见、红外两个区域的光；石英棱镜可色散波长范围为185～4000nm的光，可色散可见、紫外、红外三个区域的光。

(2)光栅单色器：色散原理是光的衍射和干涉作用。它能色散紫外、可见和近红外等区域的光，具有分辨率高、色散光域宽、成本低等优点，是常用的色散元件

3

吸收池

吸收池又称为比色皿，是紫外-可见分光光度计中盛放被测溶液的容器，一般有石英吸收池和玻璃吸收池两种。石英吸收池适用于可见光区和紫外光区，玻璃吸收池只能用于可见光区。挑选配对的吸收池

4

检测器

检测器的功能是检测光信号和测量单色光透过被测溶液后光强度的变化。常用的检测器是光电倍增管等。它通过光电效应将照射到检测器的光信号转换成电信号。对检测器的要求：灵敏度高，响应时间短，响应的线性关系好，对不同波长的光具有相同的响应可靠性，噪声水平低，有良好的稳定性

5

数据处理系统

信号处理系统的作用是放大信号并以适当的方式指示或记录下来。常用的数据处理系统有直读检流计、电位调节指零装置以及数字显示或自动记录装置等。 现在很多型号的紫外-可见分光光度计能连接计算机，一方面通过工作站对光度计进行操作控制，另一方面可以进行数据处理

序号

仪器类型

简   介

 1

单光束紫外-可见分光光度计

单光束紫外-可见分光光度计只有一束单色光。测定参比溶液和样品溶液时，在同一位置用同一束单色光先后进行。单光束紫外-可见分光光度计结构简单操作简便，但对光源强度的稳定性要求较高

 2

 双光束紫外-可见分光光度计

双光束紫外-可见分光光度计的光路经过单色器后再通过反射镜，被分解为度相等的两束光，一束通过参比池，另一束通过样品池。检测器在不同的瞬接收和处理参比信号和样品信号，其信号差经过信号处理系统后得出相应的果。双光束紫外-可见分光光度计不仅可以自动扫描绘制样品的吸收光谱，而可以减少或消除因光源强度不稳而引起的误差。仪器示意图见下图：

强间结且

 3

 双波长紫外=可见分光光度计

双波长紫外-可见分光光度计具有两并列的单色器，用两束不同的单色光交替照射样品溶液，测定样品溶液中待测组分在这两个波长下的吸光度差值，再根据吸光度差值求出样品溶液中待测组分的浓度。仪器示意图见下图：

操作前准备

技 能 要 求

紫外-可见 分光光度

计的校正 和检定

波长

由于环境因素对机械部分的影响，仪器的波长经常会略有变动，因此除应定期对 所用的仪器进行全面校正检定外，还应于测定前校正测定波长。常用汞灯中的较强  谱线237.83 nm、253.65 nm、275.28 nm、296.73 nm、313.16 nm、334.15 nm、365.02 nm、404.66 nm、435.83 nm、546.07 nm与576.96 nm,或用仪器中氘灯的486.02 nm  与656.10 nm谱线进行校正；钬玻璃在波长279.4 nm、287.5 nm、333.7 nm、360.9  nm、418.5 nm、460.0 nm、484.5nm、536.2 nm与637.5 nm处有尖锐吸收峰，也可用 于波长校正，但因来源不同或随着时间的推移会有微小的变化，使用时应注意。近  年来，常使用高氯酸钬溶液校正双光束紫外-可见分光光度计，以10%高氯酸溶液为  溶剂，配制含氧化钬(Ho₂O₃)4%的溶液，该溶液的吸收峰波长为241.13 nm、278.10 nm、287.18 nm、333.44 nm、345.47 nm、361.31 nm、416.28 nm、451.30 nm、485.29 nm、536.64 nm和640.52 nm。

仪器波长的允许误差：紫外光区±1 nm,500 nm附近±2nm

吸光度

的准确 度

可用重铬酸钾的硫酸溶液检定。取在120℃干燥至恒重的基准重铬酸钾约60

mg,精密称定，用0.005 mol/L硫酸溶液溶解并稀释至1000 ml,在规定的波长处测 定并计算其吸收系数，并与规定的吸收系数比较，应符合规定

波长/nm

235(最小)

257(最大)

313(最小)

350(最大)

吸 收 系 数 ( E ) 的规定值

124.5

144.0

48.6

106.6

吸收系数(EI) 的许可范围

123.0~126.0

142.8~146.2

47.0～50.3

105.5～108.5

杂散光 检查

可按下表中试剂及浓度，配制成水溶液，置1 cm石英吸收池中，在规定的波长处 测定透光率，应符合规定

试剂

浓度/(%)或(g/ml)

测定用波长/nm

透光率/(%)

碘化钠

1.00

220

<0.8

亚硝酸钠

5.00

340

<0.8

吸收池

的校正

分别在两个洁净的统一规格、同一材料的吸收池中装入同一溶剂(一般可用水),  将比色皿按相同方向放入吸收池架上，用同一波长的光(电磁辐)测定透光率，如透 光率之差在0.3%以下，可配对使用

操作前准备

技 能 要 求

狭缝宽度的选择

狭缝宽度应小于供试品吸收峰半高宽度的十分之一，否则测得的吸光度值会偏

低；选择狭缝宽度时，应以减小狭缝宽度时供试品的吸光度不再增大为准。对于《中

国药典》中记载的紫外-可见分光光度法测定的大部分品种，可以使用2 mm狭缝宽

度。当吸收峰的半高宽小于20 mm时，则应使用较窄的狭缝，例如青霉素钾(钠)的

吸光度检查需用1 mm狭缝宽度或更窄的狭缝，否则其264 nm处的吸光度会偏低

最大吸收波长的选 择

除另有规定外，应以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照，采用1 cm的石英吸

收池，在规定的吸收峰±2 nm处，测几个不同浓度的吸光度，或由仪器在规定波长附

近自动扫描测定，以核对供试品的吸收峰位置是否正确。除另有规定外，吸收峰波

长应在该品种项下规定的波长±2 nm以内，并以吸光度最大的波长作为测定波长。

一般供试品溶液的吸光度读数，以在0.3～0.7之间为宜。如果最大吸收波长不在该

品种项下规定的波长±2 nm之内，应检测试样的同一性、纯度以及仪器波长的准

确度

供试品溶液的制备

中药制剂化学成分比较复杂，且待测组分往往含量较低，因此需按照药品标准的 规定对待测供试品进行前处理，提取待测组分，制备成相应的供试品溶液后才能进行检测。前处理时一定要细心操作，要将待测组分定量转移富集到待测溶液中，从而保证测定的准确性

溶剂

含有杂原子的有机溶剂，通常具有很强的末端吸收。因此，当作溶剂使用时，它们 的使用范围均不能小于截止使用波长。例如甲醇、乙醇的截止使用波长为205 nm。另外，当溶剂不纯时，也可能增加吸收干扰。因此，在测定供试品前，应先检查所用 的溶剂在供试品所用的波长附近是否符合要求，即将溶剂置1 cm石英吸收池中，以空气为空白(空白光路中不置任何物质),测定其吸光度。溶剂和吸收池的吸光度，在220～240 nm范围内不得超过0.40,在241～250 nm范围内不得超过0.20,在

251～300 nm范围内不得超过0.10,在300 nm以上时不得超过0.05

序号

操 作 流 程

1

仪器接通电源，预热

2

根据测定波长，选择相应光源，继续预热(各型号仪器在操作顺序上略有区别)

3

将灵敏度钮置1挡

 4

将盛有供试品溶液及空白(参比)溶液的吸收池放入吸收池架，将空白(参比)溶液置光路位置，盖好供试品池盖

5

量程选择钮置T挡

6

断开光路，调节仪器零点使显示为0;打开光路，调节仪器透光率使显示为100%

7

量程选择钮置A挡

8

将供试品溶液置于光路中，读取供试品溶液的吸光度值

9

仪器使用完毕，取出吸收池，关机，登记

序号

方法

操作步骤及公式

1

吸收系数法

按药品标准规定的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸光度(A)。 A=K·C·L

根据药品标准规定的被测物质的吸收系数El益，计算供试品溶液的浓度C供(g/100ml)

2

外标一点法(对 照品比较法)

按药品标准的规定，分别配制供试品溶液和对照品溶液，在相同条件下，在规 定波长处分别测定供试品溶液和对照品溶液的吸光度，按下式计算供试品溶液中待测组分的浓度。

式中，AR为对照品溶液的吸光度；Ax为供试品溶液的吸光度；CR为对照品溶液的 浓度；Cx为供试品溶液的浓度

3

标准曲线法(工作曲线法)

配制一系列不同浓度的对照品溶液，选择合适的参比溶液，在相同条件下分别 测定各标准溶液的吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制A-C曲线

称为标准曲线或工作曲线。然后在完全相同的条件下测定供试品溶液的吸光度，从标准曲线(或工作直线)上查出供试品溶液的对应浓度，或代入回归方程 求出供试品溶液的浓度。在做精密测量时，用对照品溶液的浓度与相应的吸光 度进行线性回归，求出回归直线方程(相关系数r≥0.999),绘出回归直线(代替标准曲线),以尽量消除偶然误差。

标准曲线图

亦可利用计算器将一系列对照品溶液的浓度与相应的吸光度进行一元线性回归，求出回归方程(相关系数r≥0.999),将供试品溶液的吸光度代入回归方程，算出供试品溶液的浓度。回归方程：A=a+b·C式中，A为被测溶液吸光度；C为被测溶液浓度，g/ml;a为截距；b为斜率

标准曲线法多用于紫外-可见分光光度法，由于显色时影响颜色深浅的因素较多，有的仪器单色光纯度较差，故测定时应用对照品同时操作。本法适用于批量 供试品的分析，当仪器和测定条件固定时，标准曲线可多次使用

序号

仪  器

仪 器 简 介

1

高压输液系统

(1)贮液罐：由玻璃、不锈钢或氟塑料等化学惰性、耐腐蚀材料制成，有无色及棕色 两种贮液罐。贮液罐的位置应高于泵体，以保持输液静压差。为防止因溶剂蒸发而  引起流动相组成的改变和气体进入贮液罐，在使用过程中应密闭

(2)脱气装置：贮液罐配有抽真空及吹入惰性气体的脱气装置。脱气装置能除去  流动相液体中的气泡。如果流动相中含有气泡，在分离的过程中，气泡在高压下会 自溶剂中逸出，影响高压泵的正常工作和检测器的灵敏度。脱气的方法有加热回流 法、抽真空脱气法、吹惰性气体脱气法、超声脱气法和在线真空脱气法等

(3)高压输液泵：高效液相色谱仪的关键部件之一，用以完成流动相的输送任务。 对泵的要求：耐腐蚀，耐高压，无脉冲，输出流量范围宽，流速恒定，且泵体易于清洗 和维修。高压输液泵可分为恒压泵和恒流泵两类，常使用恒流泵(其压力随系统阻   力改变而流量不变)

(4)过滤器：在流动相进入色谱柱之前，用于除去流动相中固体颗粒杂质的直径

0.45μm的滤膜装置

(5)梯度洗脱系统：按一定程序改变混合流动相的组成，使流动相强度(极性、pH 或离子强度等)进行程序性改变的装置。根据加压的方式和溶剂混合顺序，可分为  高压与低压两种梯度洗脱系统。高压梯度洗脱系统是按预先设计的梯度程序，通过 控制溶剂贮器阀驱动器的开闭时间，使高压泵按比例将不同贮液器中的溶剂输入混 合器，溶剂在混合器中混合成流动相后进入色谱柱。低压梯度洗脱系统是在常压下 用比例阀将多种溶剂按比例混合后，再用泵增压后送入色谱柱。低压梯度洗脱系统 价格便宜，较易实现多元梯度洗脱。目前多采用低压梯度洗脱系统

2

进样系统

(1)高压进样阀：有流动相和进样两个标识，当将高压进样阀的阀门切至流动相位 置时，高压进样阀将流动相引入柱中，此时，可用微量注射器将供试品注入供试品环 管，环管通常被充满到供试品已经溢出的程度。当供试品环管被注满后，将阀口切 至进样位置，流动相进人供试品管，将供试品冲洗入柱中。应仔细校准供试品环管 使其容纳固定体积(一般为10μl~2 ml),如需改变进样体积，可更换能容纳适当体  积的供试品环管

(2)六通阀进样器：用六通阀进样器进样时，先将六通阀进样器手柄置于采样位置 (LOAD),此时进样系统与定量环接通，处于常压状态，用微量注射器(体积应大于定 量环体积)注入供试品溶液，使供试品停留在定量环中。然后转动手柄至进样位置  (INJECT),使定量环与输液管路接通，高压流动相进入定量环，将供试品带入色谱  柱中

(3)自动进样器：通过微机处理控制进样阀采样、进样和清洗等操作。把装有不同 浓度的供试品小瓶按一定顺序放到供试品架上(转盘式或排式),输入进样次数、分  析周期等程序后，仪器将自动运行

3

色谱分离系统

(1)保护柱：装在进样器与色谱柱之间的消耗性柱，具有防止供试品和进样阀垫圈 中的固体颗粒进入分析柱的作用。保护柱的填料与分析柱的填充剂相同，柱长为5  cm左右，在分析50～100个供试品之后需要更换保护柱芯

(2)色谱柱：色谱柱是高效液相色谱仪的重要部件，由柱管、柱接头和过滤片组成。

①柱管：柱管多为内部抛光的不锈钢管，能承受高压，具有化学惰性。柱内的填充 剂有两种类型，一是全多孔大颗粒无定形硅胶或氧化铝填料；二是化学键合相，化学 键合相中有十八烷基硅烷键合硅胶(又称ODS柱或C18柱)、辛基硅烷键合硅胶(C8

柱)、氨基或氰基键合相硅胶等。

一般色谱柱的内径为1~1.5mm,柱长为10～20 cm;毛细管柱内径为0.05～1 mm,柱长为3~10 cm;实验室用制备型柱内径为20～40mm,柱长为10～30 cm。

填充剂的性能(载体的形状、表面积、粒径、孔径、键合基团表面的覆盖度、含碳量 和键合类型等)以及色谱柱的填充情况，直接影响分离效果和待测组分的保留行为。 一般来说，孔径在15 nm以下的填充剂，适合分离分子量小于2000的化合物，孔径   在30 nm以上的填充剂，适合分离分子量大于2000的化合物。在中药制剂的定量

分析中，多使用ODS为填充剂的色谱柱和极性溶剂为流动相的反相色谱法。

②柱接头：连接流动相管路与色谱柱过滤片之间的连接管。柱接头相当于液流分 配器，具有耐高压的特点、保护固定相的填充形状不发生改变及使流动相匀速平稳 进入分析柱的功能。柱接头的死体积指流动相管路、柱接头和过滤片连接处的空体积。该体积不能超过色谱柱体积的1%,否则会使色谱峰变宽、分离度变小，影响分离效果。目前，大多数色谱柱已经采用内接式柱头连接。

③过滤片：色谱柱顶端的一块多孔性的金属烧结隔膜片或多孔聚四氟乙烯片，用以阻止填充物逸出或从进样系统进入固体颗粒杂质

(3)恒温装置(恒温箱):精确控制色谱柱温度的装置，有调节温度的功能

4

检测系统

(1)紫外-可见分光检测器：高效液相色谱法中使用最广的选择性检测器。紫外-可见分光检测器可分为固定波长、可变波长和二极管阵列检测器三种类型，以可变波长紫外-可见分光检测器应用最广。紫外-可见分光检测器由光源、流通池和记录器组成，其工作原理是进入检测器的组分对特定波长的紫外-可见光能产生选择性吸收，其吸收度与浓度的关系符合光吸收定律。紫外-可见分光检测器具有噪声低、灵 敏度高、重现性好、线性范围宽、无破坏性、对流动相流速和温度波动不敏感等优点 及使用范围窄、流动相选择受限制等缺点。紫外-可见分光检测器适用于梯度洗脱及制备色谱。

①固定波长检测器：以低压汞灯为光源，能发出90%的波长254 nm的光(其他波长为313 nm、365 nm、405 nm、436 nm、546 nm和579 nm)。因为得到的是固定波长的光，故不需要单色器。具有单色性好、光强度大、灵敏度高等优点，适合于多数芳香族、芳杂环、稠芳杂环以及芳香氨基酸、核酸等的检测。但其适用范围窄。

②可变波长检测器：光路系统类似紫外-可见分光光度计，使用的是一个连续的光源及光栅。一般采用氘灯或卤灯等为光源，光束经单色器分光后可“停流扫描”,选 择组分的最大吸收波长为检测波长，能提高检测灵敏度，可用于检查峰的纯度。

③二极管阵列检测器：在晶体硅胶上紧密排列一系列光电二极管，每一个二极管相当于一个单色器的出口狭缝，二极管越多，分辨率越高，一般一个二极管对应接受光谱上一个纳米带宽的单色器。工作原理：复色光通过供试品池被组分选择性吸收  后再进入单色器，照射在二极管阵列装置上，使每个纳米波长的光强度转变为相应的电信号强度，获得组分的吸收光谱，从而获得待测组分的结构信息。许多色谱工作站可将两张图谱绘在一张三维坐标上从而获得三维光谱-色谱图。进行峰纯度检查时，用峰纯度值说明某个色谱峰的纯度，数值越高，色谱峰为单峰的可能性大；数值越低，色谱峰为重叠峰的可能性大，用于指导色谱分离

(2)荧光检测器：依据光的吸收定律，通过测定待测组分吸收一定波长的光后发出的荧光的强度，求出待测组分的含量。该方法用于检测能产生荧光的物质和能进行荧光衍生化的物质，如氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化合物及酶。荧光检测器是 微量组分和体内药物分析常用的检测仪器，具有灵敏度高、选择性好的优点以及受溶剂的纯度、pH值、供试品浓度、检测温度等波动影响较大等缺点

(3)电化学检测器(ECD):测量物质电信号变化的检测器，适用于具有氧化还原性质的化合物，如含硝基、氨基等有机化合物及无机物的阴、阳离子等物质的检测。具有灵敏度高、适用于测定痕量组分等优点以及干扰多和对温度、流动相流速、流动相中氧气变化比较敏感等缺点。该类检测器主要有极谱、库仑、安培和电导检测器等类型，其中极谱、库仑、安培为伏安检测器，用于检测有氧化还原性的化合物；电导检 测器可用于检测离子型化合物。电导检测器在两电极之间施加一恒定电位，当电活性组分经过电极表面发生氧化还原反应(电极反应)时产生电位差，电位差的大小与 待测组分的浓度或重量有关；通过检测电位差的大小给出待测组分的色谱峰，进行含量测定

(4)质谱检测器(MSD):将质谱检测器连接在高校液相色谱仪的分离系统之后，经高校液相色谱仪分离的组分流出后进入质谱检测器，组分在一定条件下离子化后，按离子的质荷比将离子分离。采用选择离子监测模式，可得到某种质荷比的碎片离子的色谱图；根据色谱图的信息进行定量。质谱检测器适用于测定组分的结构、药物代谢分析和及微量痕量组分的定量分析，具有灵敏度高、选择性好、能同时给出组分结构信息的优点，但响应信号受组分的离子化效率的影响，而且仪器价格昂贵，需要专人使用和维护

(5)蒸发光散射检测器(ELSD):先将色谱洗脱液引入雾化器，在雾化器中洗脱液与匀速流动的高纯度氢气或空气混匀成微小液滴，然后进入加热的恒温漂移管中。在恒温漂移管中流动相被蒸发除去，待测组分形成气溶胶(不挥发的微小颗粒)进入 检测室。此颗粒在强光或激光照射下产生光散射(丁达尔效应),用光电二极管检测散射光的强度，将光强度放大后转变为电信号；色谱工作站依据散射光的对数响应值与组分重量的对数呈线性的关系，绘制出色谱曲线及分析结果

(6)示差折光检测器：利用响应信号与仪器常数、待测组分的浓度及待测组分与流 动相的折光率之差成正比的关系，通过示差折光检测器，将产生的折射光的强度放大后转变成电信号，进行含量测定。示差折光检测器属于通用型浓度检测器，只要组分和流动相的折光率有足够的差别，就能用示差折光检测器检测相应信号的强度。主要适用于无紫外吸收化合物的分析，如糖类、磷脂、维生素、氨基酸、甘油三酯、皂苷等化合物的分析

5

数据记录与处理系统

 数据记录与处理系统是对色谱系统的检测信号进行记录和处理成分析结果的装置，现在多用色谱工作站记录和处理色谱分析的数据。色谱工作站是由一台微型计算机控制色谱仪器，并进行数据采集和处理的一个系统，具有识别色谱峰，校正基线，解析重叠峰和畸形峰，计算保留时间、峰高、峰面积、半峰宽等峰参数，以及定量 计算组分含量的功能